摘 要： 目的 探討D-半乳糖聯合三氯化鋁 (AlCl₃) 對C57小鼠海馬B淋巴細胞瘤-2 (Bcl₂) 表達的影響及在阿爾茨海默病 (AD) 發病中的意義。方法 D-半乳糖90 mg·kg-1·d-1聯合AlCl3 40 mg·kg-1·d-1連續90 d腹腔注射制造AD小鼠模型;通過比較全腦圖片及糖水實驗初步鑒定模型復制是否成功;免疫組化檢測AD及野生型對照組小鼠海馬CA1、CA3和DG區Bcl2蛋白表達水平。結果 與對照組比較, AD小鼠完整腦組織表面泛白、無血色, 血管明顯減少。糖水偏好實驗:與對照組比較, AD組小鼠糖水偏好百分比明顯下降 (P<0.01) 。與對照組相比, AD小鼠海馬CA1、CA3和DG區Bcl2蛋白陽性表達明顯減少, 呈深棕色陽性顆粒數目明顯減少 (CA1、CA3區P<0.05;DG區P<0.01) 。結論 D-半乳糖聯合三氯化鋁通過抑制Bcl2的表達, 導致海馬神經細胞異常凋亡, 進而引起AD的發生、發展。 阿爾茨海默病 (AD) 又稱老年性癡呆, 是發生于老年和老年前期、以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經系統病變, 是一種慢性進行性中樞神經系統變性疾病。基底前腦膽堿能神經元丟失、神經原纖維纏結 (NFT) 和老年斑 (SP) 等為AD的主要病理特征。細胞凋亡信號通路在中樞神經系統的生長發育、衰老退化進程中都起著關鍵作用。在發育過程中, 為對抗一因多效, 細胞凋亡會損傷一些衰老的細胞, 利用這種程序性的方式, 可以將這些衰老的神經細胞移除。在成年腦組織中, 神經元通過抗細胞凋亡保持神經突觸的可塑性并維持生存。B淋巴細胞瘤-2 (Bcl₂) 屬于抗細胞凋亡家族成員, 可以調節某些前細胞凋亡因子, 如Bax的表達。此外, 增加Bcl2的表達可以降低Bax表達, 抑制凋亡復合體的形成, 達到抗細胞凋亡的目的。本研究擬觀察D-半乳糖聯合三氯化鋁對C57小鼠海馬CA1區、CA3區和DG區Bcl2表達的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

清潔級雄性C57小鼠, 購于湖北省實驗動物研究中心, 動物許可證號:SCXK (鄂) 2008-0005。

1.2 方法

1.2.1 建立AD小鼠模型

選用清潔級健康雄性C57小鼠, 體重15~20 g, 安靜環境飼養, 自由取食飲水, 通風良好, 室溫22℃~25℃, 適應性喂養1 w后隨機分為兩組, 每組15只。AD組采用Luo等的造模方法腹腔注射D-半乳糖 (武漢科瑞生物) 90 mg·kg·d (生理鹽水配制) 和Al Cl3 (天津福晨化學試劑廠) 40 mg·kg·d (生理鹽水配制) 溶液, 連續90 d;野生型對照組腹腔注射等量的生理鹽水。

1.2.2 糖水偏好實驗

用糖水和自來水雙瓶給實驗大鼠供飲, 通過測量剝奪飲水12h后大鼠1 h內的糖水和自來水消耗量, 計算糖水偏好百分比 (糖水偏好百分比=糖水消耗量/總液體消耗×100%) 。

1.2.3 免疫組織化學

1.2.3. 1 相關步驟

行為學實驗結束后, 小鼠用10%苯巴比妥 (300 mg/kg) 腹腔注射麻醉, 打開胸腔, 暴露心臟。將注射針頭插入左心室, 剪開右心耳, 快速灌注生理鹽水, 待右心耳處流出澄清液體, 換4%多聚甲醛10ml/min灌注至大鼠四肢強直, 然后將小鼠斷頭, 快速取出腦組織, 置4%多聚甲醛中固定、過夜。常規石蠟包埋腦組織, 約5μl矢狀切片。切片常規脫蠟, 將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液微波爐加熱至沸騰, 3 min×5次。冷卻后磷酸鹽緩沖液 (PBS, p H 7.2~7.6) 洗滌3次。滴加3%H2O2室溫孵育15 min (消除內源性過氧化物酶的活性) , PBS洗3 min×3次。正常山羊血清封閉, 室溫孵育10 min。傾去血清, 不洗, 滴加一抗鼠抗Bcl2抗體 (1∶200, A0208, Abclonal公司, 美國) , 4℃過夜, PBS洗3 min×3次, 滴加生物素標記的二抗, 37℃孵育20 min, PBS洗3 min×3次。二氨基聯苯胺 (DAB) (GK600710, 上海基因科技公司) 顯色, 顯微鏡下控制顯色。蘇木精復染, 梯度酒精脫水, 二甲苯透明, 中性樹膠封片后鏡下觀察蛋白表達, 拍照, 留存。

1.2.3. 2 結果判讀及圖像分析

顯微鏡下觀察海馬CA1區、CA3區和DG區胞質出現棕黃色的物質為Bcl2陽性染色。采用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統, 對每例Bcl2免疫組化染色切片的陽性表達顆粒進行定量測量。每張切片放大10×40倍, 隨機選取5個視野, 測量Bcl-2陽性表達細胞的平均光密度 (OD值) 。

1.3 統計學方法

應用SPSS20.0統計軟件, 計量資料組間比較行t檢驗。

2 結果

2.1 AD和對照組全腦圖

與對照組比較, AD小鼠完整腦組織表面泛白、無血色, 血管明顯減少, 表明D-半乳糖聯合三氯化鋁已經對小鼠的腦組織形成退行性損傷。見圖1。

圖1 AD組和對照組小鼠全腦圖

2.2 體重比較和糖水偏好實驗結果

與對照組〔 (24.87±2.21) g〕比較, AD組小鼠的體重〔 (20.98±1.65) g〕明顯下降 (P<0.05) ;與對照組〔 (94.38±8.39) η/%〕比較, AD組小鼠糖水偏好百分比〔 (56.67±4.46) η/%〕明顯下降 (P<0.01) 。

2.3 免疫組化結果

與對照組相比, AD小鼠海馬CA1、CA3和DG區Bcl2蛋白陽性表達明顯減少, 呈深棕色陽性顆粒數目明顯減少 (P<0.05, P<0.01) 。見圖2, 表1。

圖2 兩組小鼠各區Bcl2表達免疫組化結果 (×400)

表1 兩組小鼠海馬各區Bcl2蛋白的表達比較 (n=15, ±s)

3 討論

Luo等的實驗結果表明, 利用D-半乳糖聯合三氯化鋁制備AD小鼠模型, AD組小鼠表現為學習記憶減退、皮質和海馬區β淀粉樣蛋白 (Aβ) 水平增高、Aβ代謝相關分子表達受影響, 可形成NFT、SP等典型的AD癥狀, 表明D-半乳糖聯合三氯化鋁誘導AD小鼠是一種穩定的、為國內外科研工作者所接受的AD動物模型。最新研究表明, D-半乳糖聯合三氯化鋁可造成小鼠海馬區超氧化物歧化酶 (SOD) 等的活性下降, 導致學習記憶能力降低等AD癥狀的產生。神經細胞凋亡增加與神經退行性病變, 如AD等高度正相關, 細胞凋亡是導致學習、記憶退行性病變的機制之一。海馬在認知、學習、記憶形成過程中起著重要作用。Bcl2在細胞線粒體外膜表面, 通過抑制線粒體釋放凋亡誘導因子 (AIF) , 抑制內質網釋放Ca等;同時, 通過調節線粒體內外膜的通透性抗細胞凋亡;此外, Bcl2還可抑制細胞超氧化合物的積累;Bax/Bax同源二聚體可以被Bcl2/Bax異源二聚體競爭性抑制, 從而達到抗細胞凋亡的目的。Bcl2可能通過維持細胞內鈣穩態, 抑制促凋亡蛋白的釋放, 抑制凋亡蛋白酶的活化及直接抗氧化等抗細胞凋亡。

免疫組化檢測結果提示, D-半乳糖聯合三氯化鋁通過抑制抗細胞凋亡因子Bcl2的表達, 激活程序性的細胞凋亡信號通路, 導致海馬神經細胞異常凋亡, 進而引起AD的發生、發展。

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作者簡介：劉洋 (1979-) , 男, 博士, 講師, 主要從事神經退行性疾病分子機制研究。

作者簡介：陳瑤 (1982-) , 女, 碩士, 主治醫師, 主要從事神經退行性疾病發病機制研究。